除了两位水管工兄弟,游戏中的经典角色也在电影中亮相。碧姬公主作为蘑菇王国意志坚定的统治者,在片中对马力欧进行了严酷的作战训练,以帮助后者挖掘自身潜力。喜剧演员杰克·布莱克、塞斯·罗根则为片中的大反派酷霸,以及“搞笑担当”大猩猩咚奇刚配音。值得一提的还有,为游戏中的马力欧和路易吉兄弟配音长达三十余年的查尔斯·马丁内斯,也在片中友情客串。其他三个角色,同样身处迷局中央。王龙正扮演的神秘人江河突然出现在汕头,他身上究竟背负何种机密任务?王紫璇饰演的咖啡店老板娘竹君,其八面玲珑的外表下又隐藏着怎样的秘密?尹正扮演的汕头纨绔子弟十二少,看似跟整个棋局最扯不上关系,可他的内心是否真如表面那般漫不经心?